Bacillus Subtilis'in Yem Mikrobiyal Preparatlarında Test Edilmesi

ICS 65.120                                                                                                                  Csınıflandırma numarası: B 46

GB/T 26428-2010

PÇin Halk Cumhuriyeti Ulusal Standartları

Yemlerde Bacillus Subtilis için Test Standardı

Yayınlanma tarihi: 2011-01-14                                                                                  

Uygulandı: 2011-07-01 

Veren kuruluş:PÇin Halk Cumhuriyeti Genel Kalite Denetimi, Muayene ve Karantina İdaresi ve Çin Ulusal Standardizasyon Yönetim Komitesi

Önsöz

Bu standart GB/T 1.1-2009 düzenlemelerine göre hazırlanmıştır.

Bu standart, Ulusal Yem Endüstrisi Standardizasyon Teknik Komitesi'nin (SAC/TC 76) yetkisi altındadır.

Bu standart, Guangdong Eyaleti Mikrobiyolojik Analiz ve Test Merkezi tarafından önerilmiş ve hazırlanmıştır.

Bu standardın ana hazırlayıcıları: Honghui Zhu, Xiaotang Sun, Songzhen Yang, Yuanliang Chen ve Xianjiao Zhang.

Bacillus Subtilis'in Yem Mikrobiyal Preparatlarında Test Edilmesi

1. Uygulama kapsamı

Bu standart, yem mikrobiyal müstahzarlarında basil subtilis testi için düzenlemeleri tanımlar.

Bu standart, yem mikrobiyal müstahzarlarında bacillus subtilis deneyleri ve hesaplamaları için geçerlidir.

2. Normatif referanslar

Bu belgenin uygulanması için aşağıdaki belgeler gereklidir. Tarihli referanslar için, bu belge için sadece tarihli versiyon geçerlidir. Tarihsiz atıfta bulunulan belgeler için, bu belge için en son sürüm (tüm değişiklikler dahil) geçerlidir:

GB/T 8170 Sayısal Yuvarlama Kuralları ve Sınır Değerlerin İfadesi ve Yargılanması

GB/T 14699.1 Besleme Örneklemesi (GB/T 14699.1 – 2005, ISO 6497: 2002, IDT)

GB/T 20195 Hayvan Yemi: Numune Hazırlama (GB/T 20195 – 2006, ISO 6498: 1998, IDT)

3. Seyrelticiler, Ortamlar ve Reaktifler

Aksi belirtilmedikçe, analizde yalnızca analitik olarak saf reaktifler ve damıtılmış veya deiyonize veya eşdeğer saf su kullanılacaktır.

3.1.  %0.85 Sterilize Tuzlu Su

3.2.  Nutritional Agar (NA) besiyeri, bkz. Ek A, A.1

3.3.  Gram Boyama solüsyonu, bkz. Ek A, A.2.

3.4.  %7 Sodyum Klorür yetiştirme ortamı, bkz. Ek A, A.3

3.5.  Ortamların ve reaktiflerin VP testi, bkz. Ek A, A.4

3.6.  Nitrat indirgeme ortamı ve reaktifler, bkz. Ek A, A.5

3.7.  D-mannitol fermantasyon ortamı, bkz. Ek A, A.6.

3.8.  Propiyonat kullanım ortamı, bkz. Ek A, A.7

4. Ekipman ve Züccaciye

Mikrobiyolojide yaygın olarak kullanılan laboratuvar ekipmanlarına ek olarak, diğer ekipman ve cam eşyalar aşağıda listelenmiştir:

4.1.  Termostatik İnkübatör: 37 ºC ± 1 ºC

4.2.  pH metre, ± 0.1 birime kadar hassas

4.3.  Cam veya plastik petri kabı

4.4.  Scaled pipette with marking capacities of 1 ml and 10 ml, with a minimum scale of 0.1 ml and 0.5 ml respectively

4.5.  Glass or plastic-coated rod

4.6.  Microscope, with 1000 times zoom

5. Sampling

The test samples are real and representative. Sampling tools such as shovels, spoons samplers, test tubes, jars, scissors, etc. should be sterilized.

The samples should be sent to the microbiological testing room as soon as possible. The size and method of sampling should be implemented according to GB/T 14699.1.

6. Sample Preparation

The sample preparation should be implemented according to GB/T 20195, and the sample should be inspected as soon as possible after preparation.

7. Operation Procedures

7.1.  Sample Preparation for Inspection & Initial Suspension and Ten-Fold Dilution.

Aseptik işlemler ve koşullar kullanılarak, 25 g (ml) numune tartılır, 225 ml %0.85 sterilize edilmiş fizyolojik salin eklenir, 1-2 dakika homojenize edilir ve 1:10'luk bir başlangıç ​​süspansiyonu yapılır. Daha sonra 1:10'luk ilk süspansiyondan 1 ml çekin, 9 ml %0,85 sterilize edilmiş fizyolojik salin ekleyin ve 1:100 seyreltme yapmak için iyice karıştırın. Numunenin bakteri içeriğine göre ayrıca on kat seri artan seyreltme yapın.

7.2.  Aşılama ve Kültür

2-3 uygun dilüsyon seçin, 80 ºC ± 1 ºC'deki su banyosunda 10 dakika tutun ve muhafaza edin, steril bir pipetle 0.1 ml çekin ve iki beslenme agar plakasını inoküle edin (3.2). Aşıyı agar yüzeyine mümkün olduğunca dikkatli ve hızlı bir şekilde uygulamak için kaplama çubuğunu kullanın. Kaplama çubuğu petri kabının kenarına değmemelidir. Her yemek için steril bir kaplama çubuğu kullanın. Kaplanmış petri kabını kapatın ve inokulumun agar tarafından tamamen emilmesi için oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Plakayı ters çevirin ve 48 ± 2 saat boyunca 37 ºC ± 1 ºC'de bir inkübatöre yerleştirin.

7.3. Koloni Sayımı ve Tarama

İnkübasyondan sonra koloni sayısı 30-300 arasında olan bir plaka seçin. Tabakta büyük pul şeklindeki koloniler büyürse, kullanım için beyan edilmez. Bununla birlikte, pul şeklindeki koloniler tabağın yarısından azsa ve kalan yarıdaki kolonilerin dağılımı çok düzgün ise, çanaktaki koloni sayısının yarısını hesaplayabilir ve sonucu temsil etmek için sonucu 2 ile çarpabilirsiniz. yemeğin toplam koloni sayısı. Tipik Bacillus Subtilis kolonisi pürüzlü, opak, parlak olmayan, kenarları geniş, yuvarlak veya dalgalı, düzensiz şekilli ve görünüşte grimsi beyaz veya sarımsıdır. Son olarak, deney onayı için bu özelliklere sahip 5 koloni seçin.

7.4. Onay Testi

7.4.1. genel bakış

Halihazırda ticari biyokimyasal tanımlama kitlerinde veya biyokimyasal tanımlama tüplerinde kullanılan kültür besiyeri, bu standardın doğrulama testinde kullanılan besiyeri ile aynı ise, bu kitler veya tüpler, bu teyidi gerçekleştirmek için ürün talimatlarına uygun olarak kullanılabilir. Deney.

7.4.2. Gerinim Hazırlama

Petri kabından tek bir koloni seçin ve kültürü besleyici agar plakasına sürün ve 37 ºC ± 1 ºC'de 48 ± 2 saat yetiştirin. Her tabaktan en az bir iyi izole edilmiş karakteristik koloni alınmalı, sürmeli ve agar kabına aktarılmalı ve doğrulama testi için saklanmalıdır.

7.4.3. Morfolojik Gözlem

Seçilen saflaştırılmış koloniler, Gram Boyama mikroskopisi (3.3) ile incelendi. Bacillus Subtilis hücreleri çubuk şeklinde, sporları oval, Mesozoyik veya Mesozoyik'e yakın olmalı ve kistler önemli ölçüde büyütülmemelidir.

7.4.4. Fizikokimyasal Doğrulama Testi

Saflaştırılmış koloniler, %7 sodyum klorür büyümesi (3.4), VP testi (3.5), nitrat indirgemesi (3.6), D-mannitol fermantasyonu (3.7) ve propiyonat kullanımı (3.8) testi için seçildi.

7.4.5. Sonuçların Onaylanması

Sonuçların teyidi aşağıda listelendiği gibidir:

1. Bacillus Subtilis kolonileri pürüzlü yüzeylere sahiptir, opak, grimsi beyaz veya sarımsı görünümdedir, oval şekilli sporlarla çubuk şeklindedir, Mesozoyik veya Mesozoyik'e yakın, önemli ölçüde genişlememiş kistleri vardır.

2. Test sonuçları, %7 sodyum klorür büyümesi, VP testi ve nitrat azalması için pozitiftir.

3. Asit, D-mannitol fermantasyonu yoluyla üretilebilir.

4. Propionat kullanılmadan Bacillus Subtilis olarak değerlendirilip belirlenebilir.

Bacillus Subtilis ve Bacillus benzeri bakterilerin ayırt edici özellikleri aşağıda Tablo 1'de gösterilmiştir.

Tablo 1. Bacillus Subtilis ve Bacillus Benzeri Bakterilerin Ayırt Edici Özellikleri

8. Sonuçların Hesaplanması ve Rapor

8.1.  Her tabaktaki Bacillus Subtilis Kolonilerinin Sayısının Hesaplanması.

Bacillus Subtilis kolonilerinin sayısını hesaplayın (a) Formül 1'i kullanarak her yemeğin üzerine:

formül 1

bir =(b ÷ A) x C

Efsane:

a:Her tabaktaki Bacillus Subtilis kolonilerinin sayısı;

b:Örnek seçiminden sonra Bacillus Subtilis kolonileri olarak teyit edilen koloni sayısı;

A:Teyit için seçilen koloni sayısı (5);

C:Ayırt edici özelliklerini bünyesinde barındıran çanak üzerindeki koloni sayısı basil subtilis

Nihai sonuç (a) GB/T 8170'deki sayısal yuvarlama kurallarına göre en yakın tam sayıya yuvarlanmalıdır.

Örneğin:

Çanak üzerinde Bacillus Subtilis özelliklerine sahip toplam 78 koloni varsa, doğrulama testi için 5 tanesi seçilir ve 4 tanesinin Bacillus Subtilis kolonisi olduğu doğrulanırsa:

a= (4 / 5) x 78 = 62.4

a= 62.4 ~ 62

GB/T 8170'deki sayısal yuvarlama kurallarına göre, Bacillus Subtilis kolonilerinin sayısı (a) bu yemekte 62'dir.

8.2.  Örnekteki Bacillus Subtilis Koloni Sayısı: Hesaplama Yöntemi ve Rapor

2 seri seyreltme kabı seçin (her seyreltme, tabakta 30 – 300 arasında onaylanmış sayıda Bacillus Subtilis ile en az bir kap içermelidir), örnekte 1 ml veya 1 g Bacillus Subtilis olan Formül 2'yi kullanarak hesaplayın. , N.

formül 2

N = Ʃa / V (n₁ + 0.1n₂) · d

Efsane:

N:Örnekteki toplam Bacillus Subtilis sayısı;

Ʃa:Tüm tabaklarda teyit edilen Bacillus Subtilis'in toplam miktarı;

İÇİNDE:Kabın aşılama hacmi, ml;

n₁:İlk seyreltme için bulaşık sayısı;

n₂:İkinci seyreltme için tabak sayısı;

d:İlk seyreltmenin seyreltme faktörü (değeridseyreltilmemiş numuneler için 1)'dir.

Nihai sonuç (N), GB/T 8170'deki sayısal yuvarlama kurallarına göre en yakın 2 anlamlı basamağa yuvarlanmalıdır. Örnekteki Bacillus Subtilis kolonilerinin sayısı Bilimsel Gösterim kullanılarak da kaydedilebilir (1.0 – 9.9 kez 10^x).

Numune, CFU/g veya CFU/ml, ml veya g başına tahmini Bacillus Subtilis sayısını bildirin.

Örnek 1:

İlk seyreltmeden sonra (10^-3), Bacillus Subtilis kolonilerinin teyit edilen sayısı sırasıyla 168 ve 215'tir ve ikinci seyreltmeden sonra (10^-4), Bacillus Subtilis kolonilerinin teyit edilen sayısı sırasıyla 34 ve 35'tir, bu durumda:

N = (168 + 215 + 34 + 35) / [0,1 x (2 + 0,1 · 2) x 10^-3]

N = 472 / 0.00022

N = 2145450 ~ 2100000

GB/T 8170'deki sayısal yuvarlama kurallarına göre, bu örnekte g veya ml birimlerinde tahmini Bacillus Subtilis sayısı 2100000 CFU/g (veya ml) veya 2,1 x 10'dur.⁶ CFU/g (veya ml).

Örnek 2:

Eğer son seyreltme (10^-4) Bacillus Subtilis kolonilerinin sayısının sırasıyla 120 ve 130 olduğunu onaylar, ardından:

N = (120 + 130) / (0,1 x 2 x 10^-4)

N = 250 / 0.00002

N = 12500000 ~ 12000000

GB/T 8170'deki sayısal yuvarlama kurallarına göre, bu örnekteki örneğin g veya ml biriminde tahmini Bacillus Subtilis sayısı 12000000 CFU/g (veya ml) veya 1,2 x 10'dur.⁷ CFU/g (veya ml).